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Accueil > Départements > Biochimie, Biophysique et Biologie Structurale > Philippe MINARD : Modélisation et Ingénierie des Protéines

Philippe MINARD : Présentation de l’équipe

L’objectif de l’équipe est de créer de nouvelles protéines et de nouveaux sites de fixation dans les protéines par des méthodes d’évolution dirigée. Nous avons ainsi conçu une famille de protéines artificielles : les alphaRep. Ces protéines sont repliées, très stables et capables d’interagir fortement et spécifiquement avec d’autres protéines cibles choisies a priori.

Toutes les protéines naturelles ont des capacités de reconnaissance moléculaire extrêmement sophistiquées qui sont invariablement essentielles pour leur rôle biologique. Un de nos objectifs est de parvenir à construire des protéines ayant des capacités de reconnaissance moléculaire nouvelles. Cela permettrait tout d’abord de créer des objets utiles. En effet, une protéine reconnaissant une molécule cible choisie pourra ensuite être utilisée pour la détecter, étudier sa structure ou modifier son activité dans une cellule. Il s’agit aussi de comprendre comment de telles capacités de reconnaissance peuvent émerger naturellement, par un processus évolutif. Pour créer des protéines spécifiques, nous utilisons en effet des méthodes qui miment les processus d’évolution qui sont à l’origine des protéines naturelles.

Nos travaux reposent sur la fonctionnalisation d’ossature protéique. L’idée générale est de modifier aléatoirement une partie de la surface d’une protéine de façon à créer un site d’interaction. Cela conduit à constituer, par des méthodes de biologie moléculaire, une collection extrêmement vaste (appelée banque ou bibliothèque) de protéines dérivées de l’ossature de départ. Au sein de cette collection, les protéines ont toutes la même architecture générale, mais chacune a un site de fixation dont la composition chimique lui est propre. Des méthodes de tri génétique, reposant par exemple sur l’exposition sur phage, permettent ensuite de sélectionner au sein de cet ensemble les quelques séquences qui auront la capacité d’interagir spécifiquement avec toute cible préalablement choisie.

Nous travaillons sur diverses ossatures protéiques mais plus particulièrement sur un groupe de protéines à motifs répétés initialement trouvées chez un microorganisme thermophile. Nous avons pu identifier les corrélations séquence/structure au sein de ce groupe, ce qui nous a permis de concevoir une famille de protéines artificielles constituées par la répétition d’un motif idéalisé. Ces protéines artificielles appelées alphaRep ont été produites à partir de gènes synthétiques, puis caractérisées. Elles sont efficacement produites, solubles, bien repliées et extrêmement stables. Chaque motif se replie en formant deux hélices alpha antiparallèles, et s’associe avec les motifs précédents pour former un solénoïde. La face externe de la seconde hélice alpha de chaque motif est composée d’acides aminés extrêmement variables d’un motif à l’autre. La structure tridimensionnelle montre que ces positions variables sont juxtaposées dans la structure si bien que toute une face de la protéine est une macro surface hypervariable qui peut lui permettre de reconnaitre un partenaire.

Nous avons ensuite créé une bibliothèque très diverse (plus d’un milliards de clones différents) basée sur cette conception puis sélectionné à partir de cette bibliothèque des alphaRep interagissant spécifiquement avec des protéines cibles choisies a priori. Des interacteurs spécifiques ont été obtenus pour un grand nombre de protéines cibles différentes. L’affinité de chaque alphaRep pour sa cible est assez élevée avec des constantes de dissociation comprises entre quelques nM et quelques µM. La structure cristallographique de plusieurs complexes formés entre les alphaRep et leur cible a été résolue et montre que les alphaRep interagissent avec la surface de leur cible par leur propre surface hypervariable.

Nous explorons diverses applications de ces protéines. Elles peuvent être exprimées de façon stable et fonctionnelle dans le cytoplasme de cellules eucaryotes vivantes, et peuvent donc être exploités pour visualiser ou interférer spécifiquement avec un composant cellulaire cible. Nous avons également observé que les alphaRep stabilisent des protéines instables sur lesquelles elles se fixent et facilitent de façon nette le processus de cristallisation favorisant efficacement les études structurales par cristallographie.

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Structure cristallographique dune protéine artificielle à motifs répétés.
Les alphaReps sont constituées par la répétition d’un motif interne (en vert) entre deux motifs d’éxtrémités (en rouge) appelés N et C-caps. La surface d’interaction est constituée de résidus hautement variable (en jaune) situés sur l’une des faces de la protéine.
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Structure cristallographique d’une protéine FNE associée au caractère pathogène de certains streptocoques
La protéine FNE (en orange) a été cristallisée en complexe avec une alphaRep spécifique. Cette protéine ne cristallise pas à l’état isolé et sa structure n’a pu être déterminée que sous sa forme complexée avec l’alphaRep.

Contact


MINARD Philippe [Professeur - UPSud]
Equipe Minard P. - Modélisation et Ingénierie des Protéines [Responsable]
01 69 15 71 39 Orsay - Bât 430

publié le , mis à jour le