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Accueil > Départements > Microbiologie > Michael DUBOW : Génomique et Biodiversité microbienne des biofilms

Sécrétion des protéines (transporteur ABC), rôle du Ca2+ chez E. coli, communautés migratrices chez B. subtilis

Barry HOLLAND

Thèmes de recherche

Ils comprennent le mécanisme d’action des transporteurs ABC et le système de sécrétion de type I chez les bactéries, en particulier. Un autre projet concerne le processus encore peu compris de l’homéostasie du calcium chez les bactéries et le puzzle majeur, quels sont les transporteurs de l’influx et de l’efflux chez Escherichia coli. De plus, récemment, en collaboration avec Simone Séror, nous avons initié l’étude de la base moléculaire du phénomène fascinant de la migration bactérienne chez Bacillus subtilis, en utilisant une approche multidisciplinaire.

Sécrétion de type I des protéines (transporteur ABC dépendant)

Le système qui transporte la toxine hémolysine (HlyA) directement du cytoplasme vers le milieu externe, est le prototype de la grande famille des protéines RTX, comprenant les toxines produites par la plupart des pathogènes majeurs. Cette famille est caractérisée par la présence de nombreuses répétitions de nonapeptides qui fixent spécifiquement le Ca2+ et d’un signal de sécrétion à l’extrémité C-terminale. Nos travaux antérieurs ont concerné l’identification et la caractérisation du signal de sécrétion de HlyA (approximativement les derniers 60 aa) ainsi que caractérisation de deux protéines essentielles pour la sécrétion, HlyB et HlyD. HlyB est un transporteur ABC (Holland, 2010) qui possède un domaine transmembranaire (TMD) dans la membrane interne et une ATPase ABC cytoplasmique. alors que HlyD, également ancrée dans la membrane interne, interagit avec HlyB et une protéine de la membrane externe, TolC, pour former un tunnel continu à travers l’enveloppe cellulaire et sortir vers l’extérieur (V Koronakis et al., 2004).

Au cours de travaux avec le Professeur Lutz Schmitt (Düsseldorf), nous avons démontré une interaction spécifique entre le signal de sécrétion de HlyA et le domaine NBD (nucleotide binding domain) de HlyB. Les structures cristallines de toutes les étapes du cycle catalytique du NBD ont été obtenues. Ceci a révélé des changements conformationnels résultant en un mouvement substantiel du sous-domaine hélical du NBD par rapport au sous-domaine catalytique, après la fixation d’ATP. Par conséquent, nous proposons que la liaison de l’extrémité C-terminale de HlyA au NBD induit la fixation de l’ATP et la dimérization du NBD, alors que le mouvement du domaine hélical qui l’accompagne est transmis au domaine membranaire de HlyB, pour ouvrir la voie de transport.

La translocation de HlyA se fait sous la forme dépliée (Bakkes et al., 2010) et son signal de sécrétion possède une seconde fonction – il agit apparemment de manière autocatalytique pour promouvoir le repliement calcium-dépendant de HlyA à la surface de la cellule (Jumpertz et al., 2010). La concentration nanomolaire du Ca2+ dans le cytoplasme ( R Naseem et al., 2009) est insuffisante pour le repliement, tandis que la concentration extracellulaire élevée du Ca2+ est capable de promouvoir le repliement de la toxine à la surface de la cellule. Une seconde étape essentielle dans l’initiation de la sécrétion de HlyA a été identifiée récemment. Elle implique le domaine N-terminal (CLD) de HlyB (150 kDa), qui, curieusement, correspond à une protéase dégénérée C39. Le CLD interagit spécifiquement avec HlyA, près de l’extrémité C-terminale mais en amont du signal de sécrétion. Aujourd’hui, le défi est de comprendre comment est coordonnée la fixation des deux régions de HlyA aux extrémités du transporteur ABC (CLD et NBD C-terminal) et quels sont leurs rôles respectifs dans l’initiation de la translocation.

Homeostasis du Ca2+ chez E. coli

Un rôle physiologique, s’il existe, pour le Ca2+ chez les bactéries a été controversé pendant des décades. Avec le Professeur Tony Campbell (Université du Pays de Galles), nous avons démontré que, chez E. coli, la concentration de Ca2+ libre intracellulaire est en fait strictement régulée autour de 300 nM, produisant ainsi un gradient de Ca2+ d’un facteur 10 000 entre le cytoplasme et l’extérieur (HE Jones et al., 2002 ; Naseem et al., 2008, 2009). Cette régulation paraît impliquer à la fois les systèmes d’influx et d’efflux, quoique l’identité des transporteurs correspondants reste à déterminer. Cependant, nous avons montré qu’un système majeur d’efflux dépend de l’ATP, ce qui suggère la possibilité d’une ATPase liée au transport. Dans la même etude (R Naseem et al., 2009), une analyse par micro-array a permis d’identifier 110 gènes dont l’expression est affectée par la concentration extracellulaire du Ca2+, y compris plusieurs gènes codant des enzymes de la glycolyse et du cycle de Krebs. Nous avons également détecté chez E. coli des oscillations induites par des métabolites bactériens trouvés dans l’intestin, comme le méthylglyoxal, et nous suggérons que celles-ci sont utilisées pour promouvoir la signalisation intercellulaire (AK Campbell et al., 2007). De manière intéressante, des structures cristallines récentes (voir M Wu et al., 2013) ont finalement révélé la conservation apparente des transporteurs de Ca2+ chez les bactéries, bien que leur fonction (essentielle ?) reste un mystère.

Communautés migratrices chez B. subtilis

Dans la Nature, en particulier sur une surface solide, la croissance des bactéries a lieu fréquemment sous forme de communautés au sein desquelles les bactéries s’entassent jusqu’à une densité de population élevée en 3D. Ceci est associé avec un comportement social complexe, qui implique la différenciation en sous-populations de types cellulaires spécialisés tout au long du développement de la communauté. La différenciation dépend probablement de la signalisation spatio-temporelle, y compris le quorum sensing.

Cependant, la régulation de la communication intercellulaire et l’identité de certaines molécules de signalisation est encore peu comprise. Dans ce contexte, B. subtilis est un excellent système modèle, capable de former des biofilms, par ex. des colonies sur gélose dure, ou des communautés migratrices sur gélose plus molle.

De manière importante, Simone Séror et Barry Holland ont optimisé un protocole pour B. subtillis, où la migration prend place pendant plusieurs générations sous forme d’une monocouche de cellules qui avancent, formant des profils dendritiques ramifiés complexes. C’est un système idéal pour l’étude par microscopie et l’analyse de l’expression génique en cellule unique qui permet de pister l’émergence différents types cellulaires et d’étudier leurs caractéristiques. Ceux-ci incluent les cellules spécialisées ou "swarmers" aux extrémités des dendrites (voir le film) lesquelles présentent un profil unique d’expression génique et une réduction de la taille cellulaire (K Hamze et al., 2011).

Mots-clés :

transporteur ABC – ATPase - HlyB – sécrétion des protéines (type I) – repliement des protéines – signaux de sécrétion – domaine CLD protéase C39 - toxines RTX - homéostasie du Ca2+ - E. coli

Thématiques associées :

- Analyse moléculaire des communautés migratrices chez Bacillus subtilis, Simone SEROR, Directeur de Recherche Émérite

SELECTION DE PUBLICATIONS depuis 2002

Thomas S., Holland IB & Schmitt L. (2014) The type 1 secretion pathway – the hemolysin system and beyond. BBA 1848 (8), 1629-41

Norris V., Thierry A., Amar P., Holland I.B. & Molina F. (2012) The mimic chain reaction. J. Mol. Microbiol Biotechnol, 22, 335-343

Hamze K., Autret S., Hinc K, Laalami S., Julkowska D., Briandet R., Renault M., Absalon C., Holland I.B., Putzer H & Séror S.J. (2011) Single cell analysis in situ in a Bacillus subtilis swarming community identifies distinct spatially separated subpopulations differentially expressing hag (flagellin), including specialized swarmers. Microbiology, 157, 2456-2469

Schwarz C.K., Tschapek B., Jumpertz T., Jenewein S., Lecher J., Willbold D., Panjikar S., Holland I.B., Smits S.H. & Schmitt L. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of an oligomeric species of a refolded C39 peptidase-like domain of the Escherichia coli ABC transporter haemolysin B (2011) Acta Crystallogr. Sect F Struct. Biol. Cryst. Commun. 67, 630-3

Bakkes P.J., Jenewein S., Smits S.H., Holland I.B. & Schmitt L. (2010) The rate of folding dictates substrate secretion by the Escherichia coli haemolysin type I secretion system. J. Biol. Chem. 285, 40573-40580

Jumpertz T., Chervaux C., Racher K., Zouhair M., Blight M.A., Holland I.B. & Schmitt L. (2010) Mutations affecting the extreme C terminus of E. coli haemolysin A reduce haemolytic activity by altering the folding of the toxin. Microbiology, 156, 2495-2505

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SELECTION DE LIVRES, REVUES ET COMMENTAIRES depuis 2003

Holland I.B. (2011) ABC transporters, mechanisms and biology : an overview. Essays Biochem. 50, 1-17

Linton K.J. & Holland B.H. (2011) The ABC transporters of Human physiology and disease. World Scientific

Holland I.B.. (2010) The extraordinary diversity of bacterial protein secretion mechanisms. Methods Mol Biol. 619, 1-20

Hanekop N., Zaitseva J., Jenewein S., Holland I.B. & Schmitt L. (2006) Molecular insights into the mechanism of ATP-hydrolysis by the NBD of the ABC-transporter HlyB. FEBS Lett., 580, 1036-1041

Holland I.B., Schmitt L. & Young J. (2005). Type 1 protein secretion in bacteria, the ABC-transporter dependent pathway. Mol. Membrane Biol., 22, 29-39

Holland I.B. (2004) Bacterial protein translocation : an overview. BBA (Biomembranes), 1694 (1-3) : 5-16

Armitage J.P., Dorman C.J., Hellingwerf K., Schmitt R., Summers D. & Holland I.B. (2003) Thinking and decision making, bacterial style : Bacterial Neural Networks, Obernai, France, 7th-12th June 2002. Mol. Microbiol., 47, 583-593

Holland I.B., Cole S.P., Kuchler K. & Higgins C.F. (2003) ABC Transporters from Bacteria to Man. Academic Press London (Elsevier). Editors I.B. Holland, SPC

Autres Activités

Barry Holland a co-établi la série annuelle des Colloques Franco-Belges d’une journée (coût zéro) sur les “Transporteurs ABC” en 2002 et continue à faire partie du Comité d’organisation. Il a aussi créé en 1999 la série de Conférences Internationales Européennes tout autant réussies, qui continuent maintenant sous le nom de “Bacterial Networks”, financées par l’ESF et l’EMBO. Barry Holland est l’éditeur principal, avec Susan Cole, Karl Kuchler et Chris Higgins, des travaux de référence sur les transporteurs ABC (“ABC Transporters from Bacteria to Man” publié en 2003 par Academic/Elsevier Press). Il a également co-édité récemment, avec Kenneth Linton, le livre “ABC-Transporters and Disease” publié en 2011 par World Scientific.

Barry Holland est éditeur des revues Molecular Biology et Membrane Biology. Il est Referee pour des revues majeures et plusieurs agences internationales de financement. Il donne régulièrement des conférences sur les Transporteurs ABC aux étudiants de niveau maîtrise et, avec Simone Séror, il a mis en place et anime une série de cours de Conversation anglaise (qui soulignent l’impact de la Science sur la Société) adressé aux étudiants en thèse et postdocs de l’Institut. Il rédige depuis 2011 un résumé mensuel des articles et commentaires majeurs parus dans les revues Nature et Science.

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HOLLAND Barry [Chercheur bénévole - UPSud - CDD]
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