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Accueil > Départements > Biochimie, Biophysique et Biologie Structurale > Francis HARAUX : Laboratoire des Protéines et Systèmes Membranaires

Mécanismes moléculaires du transport membranaire

Les acteurs du thème « Mécanismes moléculaires du transport membranaire » s’intéressent aux mécanismes moléculaires du transport de diverses molécules à travers les membranes biologiques, et en particulier aux mécanismes de transport de cations ou de phospholipides par les protéines de la famille des ATPases de type P. Nous étudions par ailleurs la protéine P-gp, de la famille des ABC, qui transporte des molécules hydrophobes. Ces protéines transmembranaires jouent en effet un rôle clé dans de nombreux processus cellulaires. Nous développons notamment des méthodes d’expression hétérologue dans la levure S. cerevisiae et de purification des protéines membranaires, et nous associons ensuite approches biochimiques, spectroscopiques et structurales pour la caractérisation des protéines étudiées.

SERCA1a

(Marc le Maire, Philippe Champeil, Christine Jaxel, Cédric Montigny)

Depuis de nombreuses années, nous nous intéressons à l’ATPase membranaire responsable du transport de Ca2+ dans le réticulum sarcoplasmique (« SERCA1a »). Notre travail a pour objectif de comprendre les réorganisations conformationnelles qui sont à la base du couplage entre l’hydrolyse d’ATP et le transport des ions. La structure de conformations très différentes de l’ATPase SERCA1a a été élucidée par cristallographie aux rayons X de cristaux obtenus en présence de calcium, d’ATP ou ses analogues, ou encore d’inhibiteurs. Pour notre part, les travaux concernant SERCA1a portent actuellement sur deux aspects. Tout d’abord, la cristallisation de SERCA1a sauvage après son expression hétérologue et sa purification grâce à l’interaction biotine-avidine a ouvert la voie à la cristallisation de mutants aux déficits fonctionnels précédemment caractérisés, en particulier par l’équipe de J.P. Andersen au Danemark. Ainsi, en collaboration avec cette équipe et les groupes danois voisins de J. V. Møller et P. Nissen, nous avons maintenant cristallisé certains de ces mutants, et résolu les structures 3D correspondantes pour trois d’entre eux. Ces structures permettent de mieux comprendre une partie du processus de transport de calcium (par exemple, Fig 1). Plus récemment, nous avons entamé l’étude du mode de régulation de SERCA1a par la sarcolipine, une petite protéine associée à SERCA1a.

Structure du mutant E309Q du transporteur de Ca2+ SERCA1ae
Ici représentée dans la membrane du réticulum sarcoplasmique.L’hydrolyse d’une molécule d’ATP a lieu dans la région cytosolique et fournit l’énergie nécessaire au transport de deux ions Ca2+ (sphères cyans). Une des étapes du transport est l’autophosphorylation d’un aspartate situé entre les domaines bleu et rouge à environ 50 Å du site de fixation membranaire des ions Ca2+. Certaines hélices α transmembranaires, importantes pour le transport sont notées de M1 à M4. Le glutamate 309 est situé sur M4. L’étude de sa mutation en glutamine aide à mieux comprendre le dialogue crucial entre les deux régions des sites actifs qui sont relativement éloignées l’une de l’autre. Figure modifiée à partir de l’article deClausen JD, Bublitz M, Arnou B, Montigny C, Jaxel C, Møller JV, Nissen P, Andersen JP, and le Maire M. (2013). SERCA mutant E309Q binds two Ca2+ ions but adopts a catalytically incompetent conformation. EMBO J., 32, 3231-3243.

Étude de transporteurs membranaires de Plasmodium falciparum, le parasite responsable de la malaria

(Christine Jaxel, José Luis Vázquez-Ibar, Manuel Garrigos, Guillaume Lenoir)

Le paludisme est une maladie parasitaire (630000 morts par an) due à un parasite protiste du genre Plasmodium, transmis par un insecte du genre Anopheles. En absence de vaccin efficace, le traitement du paludisme est dépendant de l’utilisation de médicaments, mais l’apparition en 2009 de parasites devenus résistants aux agents antipaludiques utilisés récemment (artémisinine et ses dérivés) pose de réels problèmes.

Notre projet est d’étudier des transporteurs de Plasmodium falciparum considérés comme des cibles moléculaires potentielles, telles que les ATPases P4, les protéines membranaires intégrales de l’apicoplaste, l’ATPase Ca2+ PfATP6, le transporteur ADP/ATP PfAdT et les transporteurs membranaires impliqués dans les phénomènes de résistance PfCRT et PfMDR1.

Dans le cas de PfATP6, après expression hétérologue dans la levure et purification par chromatographie d’affinité, nous avons réussi à isoler la protéine pure, active et stable sous forme solubilisée par des détergents. Cela nous a donné l’opportunité de tester de nouveaux agents potentiellement antipaludiques en cherchant des inhibiteurs de PfATP6.
En parallèle, des essais de cristallisation de ces transporteurs seront réalisés, dans le but d’obtenir une caractérisation structurale de ces cibles potentielles majeures.

Mécanisme moléculaire du transport de lipides par les ATPases P4

(Guillaume Lenoir, Hassina Azouaoui, Cédric Montigny, Philippe Champeil)

Une caractéristique essentielle des cellules eucaryotes est la distribution asymétrique des lipides qui composent les membranes de la voie sécrétoire tardive (par exemple les membranes plasmiques ou celles du trans-Golgi). En effet, alors que la phosphatidylserine (PS) et la phosphatidylethanolamine sont séquestrées dans le feuillet cytoplasmique de la membrane plasmique, la phosphatidylcholine et la sphingomyéline sont enrichies dans le feuillet exoplasmique (Fig. 1). À l’intérieur des cellules, la distribution spécifique de la PS joue un rôle primordial en physiologie cellulaire, car la charge négative de sa tête est par exemple la cible de protéines contenant des domaines C2, protéines impliquées dans des processus clés comme la phosphorylation des protéines ou la fusion membranaire. La contribution significative de la PS à la charge globalement négative du feuillet cytoplasmique de la membrane plasmique contribue aussi au recrutement d’autres protéines solubles, via une interaction avec des motifs polybasiques, et module également le fonctionnement de protéines transmembranaires. A l’inverse, la dissipation de l’asymétrie lipidique et l’exposition de PS sur le feuillet exoplasmique qui s’ensuit est un indicateur précoce de l’apoptose, et un signal de déclenchement des cascades de coagulation du sang.

La répartition asymétrique de la PS doit donc être finement régulée, et ce sont des « flippases » qui catalysent le transport de PS (mais aussi d’autres phospholipides) du feuillet exoplasmique au feuillet cytoplasmique des membranes cellulaires, par un mécanisme dépendant de l’ATP. Les ATPases de type P de la sous-famille P4 (ATPases P4) sont très probablement ces flippases (Fig. 1), et de façon remarquable, elles sont également impliquées dans le trafic vésiculaire dans les voies sécrétoires et d’endocytose. D’autres protéines jouent un rôle important dans le transport de lipides, les protéines Cdc50. Ces dernières interagissent avec les ATPases P4 et contrôlent leur adressage correct. Le rôle exact des ATPases P4 et des protéines Cdc50 au cours du transport de lipides et du trafic membranaire reste à élucider.

Jusqu’ici, les ATPases de type P ont été identifiées comme transporteurs de cations. La conservation, entre les différentes sous-familles, des résidus clés impliqués dans la catalyse, et l’architecture probablement similaire du domaine membranaire de ces enzymes, suggèrent un mécanisme de transport similaire. Comment ces ATPases ont-elles alors acquis la capacité à transporter des ions plutôt que des lipides, à fournir un site de transport membranaire suffisamment volumineux pour accommoder la fixation d’un phospholipide ? Quel est le mécanisme de transport ?

Pour répondre à ces questions, nous avons mis au point un système permettant la co-expression en grandes quantités d’une flippase de levure, la protéine Drs2p avec sa sous-unité associée Cdc50p (Jacquot et al, 2012). Cette stratégie de co-expression nous a permis de suivre l’activité du complexe Drs2p/Cdc50p dans les membranes de levures, et d’identifier un rôle spécifique du phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) dans la régulation de l’activité de la flippase (Jacquot et al, 2012). Actuellement, nous développons la purification du complexe Drs2p/Cdc50p, pour des études fonctionnelles et structurales. En associant des études par mutagenèse dirigée avec la caractérisation fonctionnelle détaillée du complexe purifié, nous souhaitons progresser dans la compréhension du mécanisme de transport de lipides par les ATPases P4.

répartition asymétrique des phospholipides dans les membranes de la voie sécrétoire tardive et rôle des ATPases P4 dans le maintien de cette asymétrie
MP : membrane plasmique ; TGN : trans-Golgi. PC : phosphatidylcholine ; PS : phosphatidylsérine ; PE : phosphatidyléthanolamine. Guillaume Lenoir/Université Paris-Sud

Mécanismes moléculaires de la multispécificité de reconnaissance et de transport actif de drogues par la P-glycoprotéine

(Stéphane Orlowski)

La P-glycoprotéine (P-gp, ABC B1) est un transporteur membranaire actif de la famille des protéines ABC, responsable de l’efflux hors de la cellule de molécules amphiphiles endogènes et surtout exogènes, d’où l’appellation de "transporteur multidrogue". Elle induit notamment la résistance multidrogue (« MDR ») des cellules tumorales à la chimiothérapie . Elle participe également aux processus déterminant les propriétés pharmacocinétiques de différentes barrières tissulaires pour des molécules d’intérêt pharmacologique : absorption au niveau de l’intestin ou de la barrière hémato-encéphalique, excrétions biliaire et urinaire. Plus généralement, elle fait partie des systèmes de détoxication cellulaire. Enfin, la P-gp est une translocase active (dans le sens "floppase") des phospholipides et du cholestérol dans la membrane plasmique. L’étude mécanistique de tous ces processus est un préalable à la possibilité de contrer de façon rationnelle et spécifique la résistance MDR en vue d’applications cliniques.

Nous nous intéressons tout particulièrement aux mécanismes moléculaires du couplage énergétique entre l’hydrolyse d’ATP et la translocation des substrats, ainsi qu’à ceux conférant à la P gp sa propriété de reconnaissance multispécifique. Nous abordons également la question, encore peu explorée, d’éventuelles relations agonistes ou antagonistes in vivo entre la fonction d’efflux cellulaire de molécules exogènes et celle de floppase des lipides membranaires.
Pour l’étude in vitro du couplage énergétique, qui nécessite le suivi parallèle de la translocation transmembranaire et de l’hydrolyse d’ATP, nous développons un modèle expérimental de vésicules membranaires utilisant des sondes fluorescentes adaptées à la détection du transport de substrats hydrophobes.
Pour l’analyse de la multispécificité de reconnaissance, notre approche consiste à étudier expérimentalement la modulation de l’activité ATPase in vitro par différents ligands, ce qui nous a permis de proposer un modèle formel de reconnaissance bipharmacophorique, que l’on précise d’un point de vue structural par homologie et docking afin de décrire plus finement le domaine de liaison multispécifique. L’approche in silico est possible grâce à une interaction étroite avec François André (LSOD) qui a développé l’étude en bio-informatique structurale de différentes isoformes de cytochromes P450.
En collaboration avec Anne Lespine du laboratoire ToxAlim de l’INRA à Toulouse, nous développons également une analyse in silico des homologues de séquence de la P-gp (les transporteurs ABC « full » de la sous-famille B) présents chez les nématodes (le modèle non-pathogène C. elegans et les parasites comme H. contortus), dans un but de prédiction fonctionnelle. L’enjeu est de mettre en évidence et caractériser les isoformes représentant des cibles thérapeutiques, dans le cadre de la lutte contre les résistances croissantes aux antihelminthiques.

Modèle de reconnaissance bipharmacophorique de la P-gp.
Modèle de reconnaissance bipharmacophorique de la P-gp.
A gauche, structure cristallographique 3D de moyenne résolution de la forme murine (bleu : moitié N-terminale de la protéine tandem ; jaune : moitié C-terminale, NBD : domaines nucléotidiques ; TMD : domaines transmembranaires), dont la chambre intérieure sert vraisemblement de domaine de liaison multispécifique. A droite, modèle de double pharmacophore établi sur quelques drogues ligands (code de 5 couleurs) par analyse enzymologique de leurs relations mutuelles (exclusives ou non) et superpositions tridimensionnelles de leurs éléments communs de reconnaissance hydrophiles et hydrophobes.

Principales collaborations

- Eva Pebay-Peyroula, Institut de Biologie Structurale, Grenoble
- Bruno Miroux, Institut de Biologie Physico-chimique, Paris
- Joost Holthuis, Université d’Osnabrück, Allemagne
- Poul Nissen et Jesper Vuust Møller, PUMPKIN, Université d’Aarhus, Danemark
- Rosa López-Marqués, PUMPKIN, Université de Copenhague, Danemark
- Isabelle Florent, Muséum d’Histoire Naturelle, Paris
- Andréas Barth, Université de Stockholm, Suède
- Anne Lespine, laboratoire ToxAlim, UMR 1331, INRA, Toulouse
- François André, LSOD, B3S, I2BC

Mots-clés

Protéines membranaires, ATPases de type P, expression hétérologue, Saccharomyces cerevisiae, détergents, purification, transport de Ca2+, transport de lipides, ATPases P4, protéines Cdc50, enzymologie, P-gp, résistance multidrogue, transporteur ABC

Composition de l’équipe

Hassina Azouaoui, doctorante
Philippe Champeil, chercheur INSERM
Manuel Garrigos, chercheur INSERM
Christine Jaxel, chercheuse CNRS
Guillaume Lenoir, maître de conférences à l’Université Paris-Sud
Marc le Maire, professeur à l’Université Paris-Sud
Cédric Montigny, ingénieur de Recherche CNRS
José Luis Vázquez-Ibar, chercheur CNRS
Stéphane Orlowski, chercheur CEA

Contact


JAXEL Christine [Chargé de Recherche - CNRS]
Equipe Haraux F. - Laboratoire des Protéines et Systèmes Membranaires
01 69 08 33 79 Saclay - Bât 528


LENOIR Guillaume [Maitre de conférences - UPSud]
Equipe Haraux F. - Laboratoire des Protéines et Systèmes Membranaires
01 69 08 75 89 Saclay - Bât 528


ORLOWSKI Stéphane [Chercheur - CEA]
Equipe Haraux F. - Laboratoire des Protéines et Systèmes Membranaires
01 69 08 95 77 Saclay - Bât 528

publié le , mis à jour le