Institut de Biologie Intégrative de la Cellule

Thématique

Les recherches en cours concernent la synthèse non ribosomale de produits naturels peptidiques, et, plus particulièrement, des cyclodipeptides et de leurs dérivés complexes, les dicétopipérazines (DKP). Les DKP constituent une large classe de produits naturels synthétisés essentiellement par des microorganismes. Leurs rôles physiologiques sont encore peu connus mais certaines DKP seraient impliquées dans des processus de communication cellulaire ; quant à leurs activités pharmacologiques, elles sont souvent remarquables et diverses telles qu’antibactériennes, antivirales ou anticancéreuses (Figure 1).

Figure 1 : Exemples de DKP bioactifs.

Le noyau cyclodipeptidique est en bleu.

Identification et décryptage de nouvelles voies de biosynthèse de petites molécules peptidiques

Bon nombre de peptides bioactifs sont synthétisés indépendamment du ribosome par des enzymes dédiées. La majorité de ces peptides non ribosomaux sont produits par de larges enzymes multimodulaires, les NRPS (Non Ribosomal Peptide Synthetase). Cependant, l’équipe, en collaboration avec l’équipe de J.-L. Pernodet (Equipe MMA, Département de Microbiologie, I2BC), a identifié une nouvelle famille d’enzymes, les synthases de cyclodipeptides (CDPS) qui produisent des cyclodipeptides variés. Ces enzymes sont souvent associées à des enzymes de modification des cyclodipeptides dans des voies de biosynthèse dévolues à la production de DKP (Figure 2). Un des objectifs de notre équipe est de poursuivre cette identification de nouvelles voies de biosynthèse et de décrypter la diversité des molécules synthétisées par ces voies de biosynthèse.

Figure 2 : Voies de biosynthèse de DKP chez différents organismes

Quelques exemples de voies de biosynthèse de DKP associant des CDPS (gènes en marron) et des enzymes de modification des cyclodipeptides (gènes en rouge : P450 ; en bleu : méthyltransférases ; en violet : diverses oxygénases) chez différents organismes.

Publications représentatives de ces travaux
Jacques I.B. et al. Analysis of 51 cyclodipeptide synthases reveals the basis for substrate specificity. Nat. Chem. Biol. (2015) 11, 721-727
Belin P. et al. The nonribosomal synthesis of diketopiperazines in tRNA-dependent cyclodipeptide synthase pathways. Nat. Prod. Rep. (2012) 29, 961-979
Seguin J. et al. Nonribosomal peptide synthesis in animals : the cyclodipeptide synthase of Nematostella. Chem. Biol. (2011)18, 1362-1368
Gondry M. et al. Cyclodipeptide synthases are a family of tRNA-dependent peptide bond-forming enzymes. Nat. Chem. Biol. (2009) 5, 414-420

Caractérisation fonctionnelle et structurale des enzymes de biosynthèse

Figure 3 : CDPS AlbC & TyrRS

Superposition de la structure de la CDPS AlbC (en vert) et de la TyrRS, avec son domaine catalytique (bleu), son domaine de liaison de l’ARNt (gris) et la Tyr substrat (orange).

La caractérisation approfondie des CDPS est en cours au laboratoire. Les études ont déjà permis de montrer que ces enzymes détournent des ARNt aminoacylés (aa-ARNt) de leur rôle canonique dans la synthèse protéique ribosomale pour les utiliser comme substrats et catalyser la formation de cyclodipeptides variés. Nous avons également mis en évidence une similitude structurale importante des CDPS avec les aminoacyl-ARNt synthétases de classe I, enzymes qui catalysent le chargement des acides aminés sur leurs ARNt correspondants pour former les aa-ARNt (Figure 3). Récemment, nous avons élucidé le mécanisme catalytique emprunté par les CDPS qui est de type ping-pong et transite par la formation successive de deux intermédiaires covalents, un aminoacyl-enzyme puis un dipeptidyl-enzyme (Figure 4). Nous avons aussi identifié de premiers déterminants de la spécificité des CDPS et ce travail se poursuit actuellement au laboratoire.

Nous nous intéressons également aux enzymes de modification des cyclodipeptides qui sont associées aux CDPS dans les voies de biosynthèse de DKP. Ainsi, nous avons étudié CYP121, un cytochrome P450 de Mycobacterium tuberculosis, qui a été décrit comme essentiel à la viabilité du pathogène. Notre travail a conduit à l’identification du cyclodipeptide substrat et du produit de la réaction catalysée par CYP121 ainsi qu’à la détermination de sa spécificité de substrat et de réaction. Par ailleurs, comme CYP121 est une nouvelle cible thérapeutique potentielle, nous développons des analogues de substrat inhibiteurs sélectifs de CYP121.

Figure 4 : Le mécanisme global emprunté par les CDPS.

Les ARNt sont aminoacylés par les aaRS (en rouge) et sont délivrés au ribosome (en bleu) pour la synthèse protéique ribosomale. Des aa-ARNt sont détournés par les CDPS (en vert) qui les utilisent comme substrats via un mécanisme ping-pong.

Publications représentatives de ces travaux
Moutiez M. et al. Unravelling the mechanism of non-ribosomal peptide synthesis by cyclodipeptide synthases. Nat. Commun. (2014) 5:5141 doi : 10.1038/ncomms6141
Sauguet L., et al. Cyclodipeptide synthases, a family of class-I aminoacyl-tRNA synthetase-like enzymes involved in non-ribosomal peptide synthesis. Nucl. Acids Res. (2011) 39, 4475-4489
Belin P. et al. Identification and structural basis of the reaction catalyzed by CYP121, an essential cytochrome P450 in Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2009) 106, 7426 -7431

Ingénierie des voies de biosynthèse des peptides non ribosomaux

Les approches d’ingénierie nécessitent de parfaire nos connaissances sur la spécificité des CDPS et des enzymes de modification, en particulier pour l’obtention de nouvelles voies de biosynthèse capables d’incorporer des acides aminés non protéinogéniques.
Ce travail est actuellement en cours au laboratoire tant au niveau des CDPS que des enzymes de modification.

Publications représentatives de ces travaux
Moutiez M. et al. Specificity determinants for the two tRNA substrates of the cyclodipeptide synthase AlbC from Streptomyces noursei. Nucl. Acids Res. (2014) 42, 7247-7258
Fonvielle M. et al. Substrate and reaction specificity of Mycobacterium tuberculosis cytochrome P450 CYP121 : insights from biochemical studies and crystal structures. J. Biol. Chem. (2013) 288, 17347-17359

Mots-clés

Métabolisme bactérien, enzymes formant des liaisons peptidiques, peptides non ribosomaux, cyclodipeptides, dicétopipérazines, produits naturels, voies de biosynthèse, ingénierie d’enzymes, biosynthèse combinatoire, biologie de synthèse