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Accueil > Départements > Biologie des Génomes > Frédéric BOCCARD : Conformation et Ségrégation du chromosome bactérien

Frédéric BOCCARD : Présentation de l’équipe

Le projet développé dans notre équipe concerne la structuration du chromosome chez le colibacille et chez les bactéries Pseudomonas. Il a pour objectif i) de révéler les principes d’organisation du chromosome, ii) de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués, iii) d’analyser la coordination de la ségrégation du chromosome avec la progression du cycle cellulaire.

Organisation du chromosome bactérien

La taille des génomes rapportée aux dimensions de la cellule impose une condensation de la molécule d’ADN. Ce processus doit néanmoins présenter une organisation dynamique permettant l’expression des gènes et la ségrégation exacte des chromosomes à chaque division cellulaire. Chez les bactéries, le chromosome est replié en une structure appelée nucléoïde. Les bases moléculaires qui dirigent l’architecture spatiale des chromosomes sont encore mal caractérisées. Notre laboratoire s’intéresse aux processus qui organisent à grande échelle le chromosome bactérien, en particulier celui des bactéries Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa.

Organisation du chromosome chez E. coli

En 2004, notre équipe a démontré que l’arrangement spatial du chromosome chez le colibacille reposait sur l’existence de quatre grandes régions d’environ 1 Mb isolées génétiquement et spatialement, appelé Macrodomaines (MD)(Valens et al., 2004). En 2008, nous avons identifié la nature du processus de structuration de l’un des MDs, le MD Ter ; une nouvelle protéine, appelée MatP, reconnaît des sites spécifiques de 13 paires de bases (sites matS) présents en une vingtaine d‘exemplaires dans cette région de 800 kb. Au cours des dernières années, nous avons également identifié la nature du MD Ori et des deux MDs latéraux appelés « Right » et « Left ». Des propriétés spécifiques concernant la mobilité de l’ADN, la ségrégation des loci et les interactions à longue distance permettent de définir la région Ori en un MD. Nous avons dévoilé la nature du MD Ori et identifié le système MaoP / maoS comme responsable de ses propriétés particulières. Un seul locus, maoS, agit comme un centre organisateur unique à partir duquel les propriétés du MD sont propagées sur l’ensemble de la région. MaoP appartient à un groupe de protéines conservées chez les entérobactéries qui ont co-évolué avec la méthylase Dam et qui comprend notamment les protéines SeqA, MukBEF et MatP, toutes impliquées dans le contrôle de la conformation et de la ségrégation des chromosomes. Nous avons également révélé que la différence entre les régions non structurées et les MD latéraux droit et gauche reposait sur leur position sur la carte génétique. Une modification de la localisation génétique d’oriC générée soit par une inversion dans le MD Ori, soit par l’insertion d’une seconde copie d’oriC change la position des MDs Right et Left ; la région chromosomique la plus proche de oriC est toujours non structurée alors que les régions plus lointaines se comportent comme des macrodomaines, indépendamment de leur séquence d’ADN. Nos résultats suggèrent donc que l’origine de la réplication joue un rôle important dans l’organisation des chromosomes chez E. coli, car elle détermine la structuration et la localisation des MD latéraux dans les cellules en croissance.
En utilisant des méthodes dites de « Capture de Conformation de Chromosome » (« 3C ») combinées à des approches de génomique, de génétique et de microscopie à fluorescence, nous avons décrit le repliement tridimensionnel du chromosome chez E. coli et caractériser l’activité de plusieurs facteurs impliqués dans l’organisation de la chromatine et la conformation du nucléoïde. À courte distance, les cartes de contacts entre sites d’ADN ont révélé la présence de domaines d’une taille comprise entre 50 kb et 300 kb, séparés par des barrières comprenant souvent des gènes de grande taille et fortement exprimés. Les contacts à longue distance rendent compte de la présence de macrodomaines. En analysant la fréquence de contact chez plusieurs mutants, nous avons révélé le mode opératoire de différents facteurs clés de la structuration du chromosome et de leurs interactions pour contrôler les contacts de sites d’ADN à courte et longue distances.

  • L’interaction de MatP avec la protéine ZapB associée au divisome favorise l’ancrage de la région Ter au centre de la cellule. Des observations microscopiques in vitro de boucles d’ADN dépendantes du MatP portant plusieurs sites matS avaient suggéré que l’organisation de la région Ter était médiée par le pontage de sites matS distants. Cependant, les analyses 3C n’ont dévoilé aucun contact intrachromosomique entre les sites matS in vivo. Nos résultats ont montré que MatP ne favorise pas les ponts d’ADN entre les sites matS, ni en cis ni en trans. Ils révèlent que les interactions MatP-ZapB au niveau du divisome sont responsables du regroupement de molécules des différentes molécules d’ADN portant des sites matS.
  • Contrairement aux protéines SMC de type condensine qui alignent les bras chromosomiques chez plusieurs bactéries comme B. subtilis ou C. crescentus, nos données permettent de proposer un modèle selon lequel le complexe SMC MukBEF chez E. coli favorise les contacts à longue distance à l’intérieur des deux réplichores et selon lequel MatP empêche la formation de ces contacts dans la région Ter. L’interaction de MatP avec le complexe MukBEF conforte le rôle de MatP comme un acteur essentiel favorisant la formation d’un domaine chromosomique, par exclusion de la condensine MukBEF.
  • Des décennies d’études biochimiques et génomiques ont été réalisées pour les trois principales « Nucleoi-Associated Proteins » (NAPs) : HU, Fis et H-NS. Pourtant, la relation entre la liaison de l’ADN local et l’organisation in vivo à grande échelle de l’ADN chromosomique n’a pas été définie. Nos résultats ont révélé des facettes importantes de ces trois NAPs dans le contrôle de la conformation des chromosomes : H-NS affecte les contacts à courte portée tandis que HU et Fis favorisent les contacts à longue distance. L’effet H-NS est en accord avec son mode opératoire consistant à réprimer l’expression génique dans des îlots géniques en se liant d’abord à des sites de nucléation de haute affinité, puis en se propageant le long de l’ADN riche en AT. HU est nécessaire avec MukBEF pour promouvoir les communications ADN à longue distance. L’absence de Fis est moins dramatique que celle de l’HU, et la diminution des communications de l’ADN à longue distance varie le long du chromosome. En résumé, en révélant les différents niveaux de contraintes sur les sites d’ADN le long du chromosome, nos résultats révèlent les principes généraux du repliement du chromosome chez E. coli.
Modèle de la formation des interactions a long distance dans le chromosome de E. coli

Organisation du chromosome chez P. aeruginosa

Notre projet vise à comprendre l’organisation et la ségrégation du chromosome chez les bactéries Pseudomonas, groupe de γ-protéobactéries impliquées dans de nombreuses pathologies, humaines et végétales, mais aussi utilisées en industrie pour leurs applications biotechnologiques.
Nos travaux actuels ont permis de démontrer une organisation longitudinale du chromosome entre les 2 pôles de la cellule, avec la présence d’une structuration particulière affectant deux régions, l’une proche de l’origine de réplication et l’autre proche du terminus de réplication. Ces travaux ont aussi révélé un positionnement préférentiel des fourches de réplication au centre de la cellule. Après réplication, les chromatides sœurs sont ségrégés séquentiellement et progressivement à des positions cellulaires spécifiques (Vallet-Gely and Boccard, 2013).

Modèle d’organisation du chromosome de P. aeruginosa

La ségrégation des chromosomes chez les bactéries se produit concomitamment à la réplication de l’ADN, et les régions dupliquées contenant l’origine de réplication oriC sont généralement les premières à se séparer et à migrer vers leur destination finale. Chez de nombreuses espèces bactériennes, une machinerie de partition à trois composants appelée système ParABS est cruciale pour la ségrégation des chromosomes. C’est notamment le cas chez P. aeruginosa, où l’altération du système ParABS conduit à la formation de cellules anucléées. En utilisant des approches d’immuno-précipitation de chromatine couplées à du séquençage à haut débit, nous avons montré que la protéine ParB se lie in vivo à quatre sites parS situés à 15 kb d’oriC, et que cette liaison favorise la formation d’un complexe nucléoprotéique. Nous avons également montré qu’un seul site parS est suffisant pour empêcher la formation de cellules anucléées, donc pour une ségrégation chromosomique efficace. En déplaçant le site parS de sa position native sur le chromosome, nous avons démontré que le site parS est le premier locus chromosomique à être séparé lors de la réplication de l’ADN, indiquant qu’il est le site sur lequel s’exerce la force du processus de ségrégation. Nous avons identifié une région d’approximativement 650 kb autour de oriC dans laquelle le site parS doit être positionné pour obtenir une ségrégation correcte ; cette région a été appelée "zone de compétence" du site parS. Des souches mutantes ayant subi des réarrangements génétiques spécifiques nous ont permis de proposer que la distance entre oriC et parS définissait cette « zone de compétence » (Lagage et al PLoS Genetics, 2016).

Mots-clés

Conformation de l’ADN, ségrégation du chromosome, Recombinaison, bactérie, cycle cellulaire, architecture cellulaire

Contact


BOCCARD Frederic [Directeur de Recherche - CNRS]
Conformation et Ségrégation du chromosome bactérien [Responsable]
01 69 82 32 17 Gif - Bât 26

publié le , mis à jour le