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Accueil > Départements > Biologie Cellulaire > Anne-Marie TASSIN : Biogenèse et fonction des structures centriolaires et ciliaires

Anne-Marie TASSIN : Présentation de l’équipe

L’ancrage des corps basaux à la membrane plasmique, étape cruciale de la ciliogénèse, implique l’assemblage de la zone de transition, qui contient des protéines dont la mutation conduit souvent à des ciliopathies. Nous disséquons ce processus d’ancrage par des approches moléculaires et de microscopie à haute résolution.

Au centre de la cellule, le centrosome se duplique à chaque cycle cellulaire. Composé de deux centrioles, le père et le fils, organelles microtubulaires hautement conservées, et entouré du matériel pétricentriolaire le centrosome assure la nucléation et l’organisation des réseaux microtubulaires. Centre organisateur de microtubules, le centrosome contrôle trafic intracellulaire, polarité et division cellulaires. En interphase, le centriole-père devient un corps basal qui s’ancre à la membrane plasmique pour générer un cil primaire, organe de transduction de signaux. Dans certains épithéliums, une multiplication massive de corps basaux génère de nombreux cils motiles. Par cette double fonction de motilité et de transducteur de signaux, les cils interviennent dans de nombreux processus développementaux et physiologiques et, chez les mammifères, leur altération détermine de nombreux désordres reconnus comme “ciliopathies”. La perte des cils, observée dans diverses tumeurs, révèle que la ciliogenèse relève aussi du cancer.

La ciliogenèse est l’aboutissement d’une succession d’étapes coordonnées dans le temps et dans l’espace pouvant différer d’un organisme à l’autre. Cependant, elle comprend plusieurs étapes clés, communes à tous les modèles cellulaires et conservées au cours de l’évolution : la duplication du centriole/corps basal, la maturation du corps basal, la migration et l’ancrage à la membrane et la croissance du cil. En plus d’une synthèse correcte des protéines impliquées, l’édification de cet organelle complexe dépend du bon déroulement des interactions moléculaires dans un espace en 4 dimensions (espace-temps). Cette étude est basée sur la synergie des modèles expérimentaux la paramécie et les cellules de mammifères.

Corps basal et cil en microscopie électronique
A gauche : coupe longitudinale d’un corps basal et de son cil montrant leur continuité à travers une zone de transition . A droite : coupes transversales au niveau des lignes noires marquées à gauche de (1) un corps basal (BB) montrant la symétrie 9 de l’organisation des triplets de microtubules et de la "roue de charette" (cw) (2) d’une zone de transition (TZ) et (3) d’un cil montrant la même symétrie 9 de l’organisation de doublets de microtubules et la présence d’une paire centrale de microtubules. Barre=200nm.

Les objectifs de note équipe sont multiples : 1) réaliser la dissection moléculaire et spatiale de l’étape d’ancrage du corps basal. 2) comprendre comment des défauts de ciliogenèse peuvent conduire au développement d’une tumeur en étudiant le rôle de la dé-ubiquitinase suppresseur de tumeur CYLD, dont nous avons montré le rôle dans l’ancrage. 3) Le microorganisme cilié - la Paramécie - est utilisé comme modèle d’étude des DCP (dyskinésie ciliaire primitive). La Paramécie offre de nombreuses avantages techniques permettant des analyses moléculaires et biochimiques rapides et efficaces des protéines impliquées dans la motilité ciliaire.
1) Nous combinons les techniques de biochimie et de biologie cellulaire avec la cryo-tomographie électronique pour :
a) Identifier et analyser de nouveaux acteurs de l’ancrage des corps basaux en utilisant la technique de la BioID.
b) Disséquer les mécanismes structuraux permettant l’établissement de la zone de transition à l’échelle nanométrique.

La déplétion de la protéine FOR20 chez la paramécie prévient l’ancrage des corps basaux
A gauche : vue en microscopie confocale d’une paramécie sauvage (en haut) et déplétée pour FOR20 (en bas) marquées par des anticorps spécifiques des corps basaux en vert et du cytosquelette cortical (épiplasme) en rouge. Au lieu d’être ancrés à la surface, les corps basaux de cellules déplétées pour FOR20 se trouvent en vrac dans le cytoplasme. A droite : vue en microscopie électronique d’une paramécie sauvage (en haut) et déplétée pour FOR20 (en bas). Les corps basaux sont ancrés à la surface dans les cellules sauvages tandis qu’on les trouve libres dans le cytoplasme

2) Notre récent travail sur les cellules de mammifère a révélé un rôle inattendu de la déubiquitinase CYLD dans l’étape de migration/ancrage du corps basal. Identifiée d’abord comme suppresseur de tumeur, CYLD est mutée dans les cylindromatoses familiales, qui prédisposent les porteurs à des tumeurs de la peau. La plupart des mutations caractérisées dans les cylindromes humains consistent en des délétions carboxy-terminale inactivant le domaine de déubiquitination. L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle des protéines impliquée dans la dégradation des protéines, la réparation de l’ADN, l’endocytose de récepteurs, l’apoptose…. Le rôle de la déubiquitination dans l’ancrage des corps basaux peut relever d’une fonction plus générale dans la ciliogenèse. De plus, nous voudrions comprendre comment les défauts de ciliogenèse observés chez les souris mutantes Cyld portant la plus petite délétion trouvée dans les pathologies humaines, peuvent être reliés à la formation de tumeurs..

3) Nous avons établi des collaborations avec des équipes de généticiens cliniques travaillant sur les DCP et réalisons l’analyse fonctionnelle chez la Paramécie de nouveaux gènes candidats impliqués dans les DCP.

Des mutations dans le gène C11orf70 empêche l’assemblage des chaînes de dynéine dépendant du trafic intraflagellaire et conduisent aux dyskinésies ciliaires primitives.
A : Analyse de la vitesse de nage après déplétion de C11orf70 ou d’un gène contrôle. B : Coupes transversales de cils de Paramécie observées en microscopie électronique à transmission montrant la présence des 9 bras de dynéines internes et externes chez les Paramécies contrôles (gauche) et l’absence des bras de dynéines externes (Flèche blanche) et internes (flèche grise) après déplétion de C11orf70 (droite), échelle 100nm. C : Les Paramécies exprimant la protéine C11orf70GFP montrent un marquage important de la GFP dans le cytoplasme et dans le cil. Le corps cellulaire est surexposé afin de permettre la détection des cils. Barre d’échelle 20µm. D : Etude de la localisation des différentes protéines pendant la reciliation : Paramécies exprimant la GFP seule (à gauche), C11orf70-GFP (milieu) ou IFT46-GFP (droite) sont déciliées et reciliées (les cils peuvent repoussés pendant 15 minutes après changement de milieu). Marquage montrant la fluorescence directe (vert, en haut) et la tubuline polyglutamylée identifiée à l’aide d’un anticorps polyclonal (polyE) (rouge, milieu) et en bas la superposition des deux marquages. Les Paramécies exprimant la GFP sont utilisées comme contrôle négatif, la GFP (27KD) pouvant entrer librement dans le cil. Par contre l’IFT46 GFP s’accumule à la pointe des cils pendant la reciliation, comme attendu pour un membre du complexe IFT-B. C11orf70GFP est localisée de manière beaucoup plus importante dans le cytoplasme que IFT46GFP mais est également présent dans le cil. C11orf70-GFP s’accumule à la pointe du cil comme IFT46-GFP pendant la reciliation. Les encarts blancs montrent un agrandissement. Barre d’échelle 10µm.

Mots clés :

Centrosome, centriole, ciliogénese, corps basal, zone de transition, cryo-tomographie, CYLD, ubiquitination, suppresseur de tumeur, dyskinésie ciliaire primitive

Contact


TASSIN Anne-Marie [Directeur de Recherche - CNRS]
Biogenèse et Fonction de la Structure Centriolaire et Ciliaire [Responsable]
01 69 82 32 13 Gif - Bât 26

publié le , mis à jour le